CEA（CEACAM5）抗體結(jié)合表位研究

癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子（CEACAM）包括CEACAM1、CEACAM3至CEACAM8、CEACAM16以及CEACAM18至CEACAM21，屬于膜相關(guān)細(xì)胞表面的糖蛋白家族，它們?cè)诩?xì)胞粘附、信號(hào)傳遞及腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著重要角色。這類分子在肺部、結(jié)直腸及胃部組織的某些腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)出表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，使其成為抗體-藥物偶聯(lián)物的一個(gè)極具潛力的靶標(biāo)。CEACAM的胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）由重復(fù)的免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域組合而成，包含一個(gè)位于N端的免疫球蛋白可變（IgV）樣結(jié)構(gòu)域，以及數(shù)量可多達(dá)六個(gè)的免疫球蛋白恒定C2（IgC2）樣結(jié)構(gòu)域（分為A型和B型）。這些結(jié)構(gòu)域在不同類型的CEACAM之間展現(xiàn)出了高度的序列一致性和結(jié)構(gòu)相似性。此外，CEACAM的ECD還包含多達(dá)28個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。糖基化的差異性對(duì)蛋白-蛋白相互作用及疾病發(fā)展進(jìn)程具有顯著影響。因此，為防止臨床診斷時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，或在免疫治療中引發(fā)脫靶效應(yīng)或靶外腫瘤毒性，CEACAM靶向抗體必須具備高度的特異性，以避免與其他類型的CEACAM發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.CEACAM5特異性抗體

Tusamitamab ravtansine（SAR408701）是一種針對(duì)CEACAM5（即CEA）的抗體-藥物偶聯(lián)物，用于治療晚期非鱗狀非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和其他實(shí)體腫瘤。其抗體成分tusamitamab靶向CEACAM5的A3-B3結(jié)構(gòu)域，不與CEACAM1、CEACAM6或CEACAM8結(jié)合，這意味著A3-B3結(jié)構(gòu)域表面存在獨(dú)特的結(jié)合區(qū)域，賦予抗體特異性。

2.抗體抗原結(jié)合界面分析

為了了解tusamitamab與CEACAM5_A3-B3的結(jié)合機(jī)制和特異性，研究人員采用了多種方法對(duì)結(jié)合界面進(jìn)行了殘基鑒定和結(jié)構(gòu)分析。

2.1研究方法

1）利用低溫電子顯微鏡（cryo-EM）描述CEACAM5 A3-B3結(jié)構(gòu)域與tusamitamab抗原結(jié)合片段（tusa Fab）復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)。
2）通過(guò)表面等離子體共振（SPR）分析丙氨酸突變對(duì)CEACAM5與tusa Fab結(jié)合的影響，進(jìn)一步表征結(jié)合界面。
3）通過(guò)氫-氘交換耦合質(zhì)譜（HDX-MS）比較CEACAM5與tusa Fab結(jié)合前后氫-氘交換的差異，鑒定表位殘基。

2.2研究結(jié)果

2.2.1cryo-EM結(jié)構(gòu)分析

1）糖基化

tusa Fab和hCEACAM5_A3-B3的結(jié)構(gòu)完全由β鏈和β片組成（圖1b）。hCEACAM5的A3和B3結(jié)構(gòu)域具有典型的IgC2結(jié)構(gòu)域β-三明治結(jié)構(gòu)。研究人員在hCEACAM5_A3-B3區(qū)域鑒定了7個(gè)聚糖，包括Asn612殘基上的N-連接甘露糖，該甘露糖與tusa Fab重鏈Gly54和Gly56殘基形成氫鍵（圖1c）。

2）結(jié)合界面

hCEACAM5-tusa Fab結(jié)構(gòu)揭示了tusa Fab的重、輕鏈與hCEACAM5_A3-B3（主要在B3區(qū)）的結(jié)合。
A.重鏈結(jié)合界面
hCEACAM5-tusa Fab重鏈結(jié)合界面的掩埋表面積覆蓋455?2，涉及hCEACAM5 B3結(jié)構(gòu)域的12個(gè)殘基（Pro621至Ser626、Gln635至Val639和Phe641）和14個(gè)tusa Fab重鏈殘基（Val28、Ser30至Asp33、Ser53和His99至Pro106）。

在這個(gè)界面中檢測(cè)到一個(gè)由8個(gè)氫鍵組成的網(wǎng)絡(luò)，有的氨基酸會(huì)形成多個(gè)氫鍵。特別是，tusa Fab重鏈殘基Ser31與3個(gè)hCEACAM5殘基（Gln635、Thr637和Val639）；tusa Fab重鏈殘基Ser104與3個(gè)hCEACAM5 殘基（Ser622和Gln624）；CEACAM5 Ser622與2個(gè)tusa Fab重鏈殘基（Ser103和Ser104）。

雖然界面中的一些殘基存在疏水效應(yīng)，但大多數(shù)殘基距離太遠(yuǎn)無(wú)法相互作用（>5 ?）。只在hCEACAM5 Phe641和tusa Fab重鏈Val28之間發(fā)現(xiàn)了1個(gè)潛在的疏水作用位點(diǎn)，殘基間距為~4.2 ?。

B.輕鏈結(jié)合界面
hCEACAM5-tusa Fab輕鏈界面的掩埋表面積達(dá)到344 ?2，涉及12個(gè)hCEACAM5氨基酸（A3結(jié)構(gòu)域：Asn509、Lys511、Val513、Asp588和Leu590；B3結(jié)構(gòu)域：Pro621、Ser622、Gln624、His636、Asn659、Leu660、Ala661）和9個(gè)tusa Fab輕鏈氨基酸（Glu27、Asn28、Phe30、Ser31、Tyr32、Tyr49、Asn50、His91、Tyr92）。hCEACAM5殘基Leu660、Lys511和Gln624分別與tusa Fab輕鏈殘基Tyr32、Tyr92和Asn50形成氫鍵。

此外，該界面有一個(gè)疏水區(qū)，涉及4個(gè)hCEACAM5殘基（Pro621、Leu590、Leu660和Ala661）和3個(gè)tusa Fab輕鏈殘基（Phe30、Tyr32和Tyr92），這些殘基在3.7 ?和4.7 ?距離上具有正ΔG_solv值。

值得注意的是，hCEACAM5 B3結(jié)構(gòu)域中的Gln624與tusa Fab重鏈和輕鏈殘基均形成氫鍵。hCEACAM5_A3-B3和tusa Fab之間的結(jié)合界面相互作用不涉及鹽橋或二硫鍵（圖2）。

圖1. hCEACAM5_A3-B3與tusa Fab復(fù)合物的低溫電鏡結(jié)構(gòu)

注：BMA：β-d-甘露糖；CDR_H2：互補(bǔ)決定區(qū)重鏈2；CEACAM5：癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5；cryo-EM：低溫電鏡；FUC：α-l-果糖；hCEACAM5：人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5；hCEACAM5_A3-B3：人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5的A3-B3結(jié)構(gòu)域；Man：α-d-甘露糖；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖；tusa Fab：tusamitama抗原結(jié)合片段。

hCEACAM5_A3-B3與tusa Fab結(jié)合的Cryo-EM圖譜。a.中右圖為左圖在縱軸上旋轉(zhuǎn)90°視圖。b.為hCEACAM5_A3-B3（金帶）與tusa Fab（洋紅和藍(lán)帶）結(jié)合的帶狀結(jié)構(gòu)示意圖。箭頭表示一個(gè)β鏈，圓棒表示N-鏈聚糖。c.hCEACAM5 B3（金帶）結(jié)構(gòu)域Asn612殘基上的N-連接甘露糖與tusa Fab重鏈（洋紅帶）之間相互作用的放大視圖。圖中tusa Fab重鏈CDR_H（藍(lán)色）Gly54、Gly56與聚糖（深灰色）之間的相互作用用虛線表示。聚糖片段周圍的線網(wǎng)表示模型與低溫電鏡密度圖的擬合結(jié)果。d.分子操作環(huán)境（MOE）生成的聚糖配體相互作用圖。hCEACAM5的相互作用殘基用圓圈表示，A和B分別表示A3和B3結(jié)構(gòu)域的殘基。

圖2.hCEACAM5_A3-B3與tusa Fab相互作用的關(guān)鍵表位

注：CDR_H：重鏈互補(bǔ)決定區(qū)；CDR_L：輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)；hCEACAM5：人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5；hCEACAM5_A3-B3：人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子A3-B3結(jié)構(gòu)域；tusa Fab：tusamitama抗原結(jié)合片段。

hCEACAM5的主架和側(cè)鏈呈灰色。a.圖中tusa Fab的CDR_H1（洋紅色）和CDR_H3（黃色）通過(guò)與CEACAM5的B3結(jié)構(gòu)域形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)來(lái)促進(jìn)相互作用；虛線表示氫鍵。CDR_H3的殘基主要在CDR_H3的Ser104、Ser103和Phe101與hCEACAM5 B3結(jié)構(gòu)域的Ser622、Gln624和His636之間形成強(qiáng)氫鍵相互作用網(wǎng)絡(luò)。CDR_H1殘基Ser31與hCEACAM5 B3結(jié)構(gòu)域的Gln635、Val639和Thr637形成氫鍵。b.CDR_L1（青色），CDR_L2（珊瑚色）和CDR_L3（綠色）與hCEACAM5_A3-B3結(jié)構(gòu)域相互作用。CDR_L1的Tyr32、CDR_L2的Asn50和CDR_L3的Tyr92分別與hCEACAM5_A3-B3結(jié)構(gòu)域的Leu660、Gln624和Leu511形成氫鍵。

2.2.2SPR分析

在初始篩選中，重鏈上的5個(gè)變體（Asp33Ala、Phe101Ala、Gly102Ala、Gly105Ala和Pro106Ala）和輕鏈上的2個(gè)變體（Tyr32Ala和Asn50Ala）完全失去與hCEACAM5_ECD的結(jié)合能力；重鏈中的4個(gè)變體（Tyr32Ala、Tyr50Ala、His99Ala和Tyr100Ala）和輕鏈中的4個(gè)變體（Phe30Ala、His91Ala、Tyr92Ala和Pro95Ala）與hCEACAM5的結(jié)合減弱。

此外，重鏈中的7個(gè)變體（Tyr32Ala、Asp33Ala、Tyr100Ala、Phe101Ala、Gly102Ala、Gly105Ala和Pro106Ala）和輕鏈中的2個(gè)變體（Tyr32Ala和Asn50Ala）完全破壞了hCEACAM5tusa Fab+Fc復(fù)合物的穩(wěn)定性。重鏈中的另外兩個(gè)變體（Tyr50Ala和His99Ala）和輕鏈中的4個(gè)變體（Phe30Ala、His91Ala、Tyr92Ala和Pro95Ala）導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性降低。

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明tusa Fab抗體結(jié)合區(qū)包含重鏈的第三個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR3）（殘基96-108）。來(lái)自重鏈CDR1（殘基32和33）、輕鏈CDR1（殘基32）和輕鏈CDR3（殘基91和92）的一些殘基也可能有助于抗體結(jié)合區(qū)相互作用。

在第二組SPR實(shí)驗(yàn)中，選擇在SPR篩選實(shí)驗(yàn)中%Rmax和%Remaining與野生型（WT）不同的20個(gè)tusa Fab+Fc變體，進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。值得注意的是，相對(duì)于tusa Fab+Fc WT（K_D=14.0nM），重鏈中的2個(gè)變體（Tyr50Ala和His99Ala）和輕鏈中的4個(gè)變體（Phe30Ala、His91Ala、Tyr92Ala和Pro95Ala）與hCEACAM5_ECD的結(jié)合親和力降低（K_D=306.5nM至13.5μM）（表1）。

表1.利用SPR分析丙氨酸突變對(duì)hCEACAM5與tusa Fab+Fc結(jié)合的影響

注：k_a：結(jié)合常數(shù)，k_d：解離常數(shù)，K_D：結(jié)合常數(shù)，t_1/2：解離半衰期，WT：野生型。
a.野生型tusa Fab和丙氨酸變體之間結(jié)合自由能變化（構(gòu)象穩(wěn)定性）的差異（ΔGWT -ΔGAla）。負(fù)值表明丙氨酸突變?cè)谀芰可鲜遣焕模矗枰萕T蛋白更多的能量來(lái)折疊）。

2.2.3HDX-MS分析

游離CEACAM5和CEACAM5-tusa Fab復(fù)合物氘?dāng)z取的差異表明CEACAM5表位涉及殘基607-613和629-641。游離tusa Fab和CEACAM5-tusa Fab復(fù)合物氘?dāng)z取的差異表明tusa Fab結(jié)合表位涉及重鏈中的101-109殘基和輕鏈中的48-54和88-104殘基。

2.2.4小結(jié)

通過(guò)多種方法（cryo-EM，SPR和HDX-MS）鑒定出tusa Fab 表位中16個(gè)氨基酸殘基（10個(gè)在重鏈上，6個(gè)在輕鏈上）（圖3a）。當(dāng)發(fā)生丙氨酸突變時(shí)，6個(gè)殘基（重鏈：Tyr32、Asp33、Tyr100和Phe101；輕鏈：Tyr32和Asn50）與hCEACAM5_A3-B3結(jié)合能力喪失，2個(gè)殘基（輕鏈：Phe30和Tyr92）的結(jié)合能力變?nèi)酢?/p>

通過(guò)丙氨酸誘變鑒定的Tusa Fab表面殘基大多與cryo-EM鑒定的殘基一致（圖3b）。綜合來(lái)看，當(dāng)聚集在低溫電鏡核心區(qū)域的殘基突變?yōu)楸彼釙r(shí)，會(huì)導(dǎo)致與hCEACAM5結(jié)合能力喪失，而當(dāng)距離更遠(yuǎn)的殘基突變?yōu)楸彼釙r(shí)，會(huì)導(dǎo)致結(jié)合變?nèi)酢DX法鑒定的hCEACAM5表位比低溫電鏡法鑒定的表位表面積小；然而，這兩種方法檢測(cè)到的相互作用核心區(qū)域都在B3結(jié)構(gòu)域（圖3c）。

圖3.hCEACAM5_A3-B3與tusa Fab結(jié)合界面的不同分析技術(shù)鑒定結(jié)果

注：Ala-Scan，丙氨酸掃描誘變；Ala+SPR，丙氨酸變體的表面等離子體共振；cryo-EM，低溫電子顯微鏡；HC，重鏈；hCEACAM5，人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5；hCEACAM5_A3-B3，人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5的A3-B3結(jié)構(gòu)域；HDX，氫-氘交換；LC，輕鏈；MAN，甘露糖；tusa Fab，tusamitamab抗原結(jié)合片段。

a.hCEACAM5_A3-B3與tusa Fab復(fù)合物中相互作用殘基的比較。氫鍵用虛線表示。b.通過(guò)丙氨酸誘變鑒定的tusa Fab表位殘基（黃色高亮表示部分結(jié)合，紅色高亮表示沒(méi)有結(jié)合）和冷凍電鏡（淺粉色高亮表示重鏈的相互作用殘基，洋紅色高亮表示輕鏈的相互作用殘基）的比較，tusa Fab重鏈和輕鏈的溶劑可溶表面分別用淺棕色和淺藍(lán)色表示。c.HDX（紅色）和cryo-EM（洋紅色）鑒定的hCEACAM5表位殘基比較。hCEACAM5_A3-B3和N-鏈聚糖的溶劑可溶表面分別為金棕色和淺棕色。b，c二級(jí)結(jié)構(gòu)（較深的帶狀結(jié)構(gòu)和球棍結(jié)構(gòu)）。

2.3討論

CEACAM蛋白家族中，CEACAM5獨(dú)特表位的確定對(duì)理解其特異性結(jié)合至關(guān)重要，特別是A3-B3結(jié)構(gòu)域的表位，對(duì)抗體-藥物偶聯(lián)機(jī)制具有重要意義。本研究通過(guò)cryo-EM、HDX-MS和SPR鑒定獲得的CEACAM5_A3-B3與tusamitamab（tusa Fab）結(jié)合表位基本一致。其中tusa Fab結(jié)合表位中的16個(gè)氨基酸殘基與抗體特異性、親和力有關(guān)。這些殘基多屬于芳香殘基（Tyr、Trp和Phe）、短親水側(cè)鏈殘基（Ser、Thr、Asp和Asn）或甘氨酸。這些殘基聚集在重鏈上（特別是CDR3），通過(guò)氫鍵或范德華力穩(wěn)定結(jié)合界面。16個(gè)殘基中有6個(gè)突變?yōu)楸彼釙r(shí)，與hCEACAM5_A3-B3結(jié)合能力喪失，2個(gè)突變后結(jié)合能力變?nèi)酢?/p>

hCEACAM5表位涉及A3和B3結(jié)構(gòu)域；Tusa Fab主要結(jié)合B3結(jié)構(gòu)域，與A3作用較少。hCEACAM5 B3結(jié)構(gòu)域主要涉及6個(gè)殘基（Ser622、Gln624、Gln635、His636、Thr637和Val639），特別是Gln624能同時(shí)與重鏈和輕鏈形成氫鍵。4個(gè)氫鍵殘基（Gln635、His636、Thr637和Val639）和1個(gè)疏水殘基（Phe641），可能對(duì)hCEACAM5表位至關(guān)重要。

此外，在B3結(jié)構(gòu)域Asn612殘基上的N-連接甘露糖與tusa Fab重鏈形成氫鍵。N-糖基化傾向于降低蛋白質(zhì)的靈活性，增加蛋白質(zhì)的整體穩(wěn)定性。因此，hCEACAM5_A3-B3中的所有N-連接聚糖，包括與Asn612連接的聚糖，可能在形成被tusa Fab和其他參與hCEACAM5細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)識(shí)別的整體構(gòu)象中發(fā)揮重要作用。聚糖在CEACAM5中的作用很重要，因?yàn)樵趆CEACAM5-tusa Fab結(jié)合界面中沒(méi)有鹽橋。鹽橋通過(guò)施加限制構(gòu)象靈活性約束在抗體-抗原相互作用中發(fā)揮重要作用。Asn612殘基上的N-連接甘露糖可能具有補(bǔ)償和穩(wěn)定功能，類似于沒(méi)有鹽橋的蛋白質(zhì)復(fù)合物中的關(guān)鍵錨定殘基；這將增加結(jié)合界面的剛性，從而提高tusa Fab對(duì)hCEACAM5_A3-B3的特異性。

研究人員推斷，tusa Fab對(duì)hCEACAM5的A3-B3結(jié)構(gòu)域的特異性是由于tusa Fab重鏈和輕鏈與hCEACAM5_A3-B3之間存在多種類型的相互作用，以及結(jié)合界面的構(gòu)象約束（形狀互補(bǔ)）。這種結(jié)合機(jī)制可能使tusamitamab能夠?qū)CEACAM5與其他人類CEACAM（即CEACAM1、6和8）區(qū)分開(kāi)，并將hCEACAM5中的A3-B3結(jié)構(gòu)域與A1-B1和A2-B2結(jié)構(gòu)域區(qū)分開(kāi)。

參考文獻(xiàn)

Kumar A, Duffieux F, Gagnaire M, et al. Structural insights into epitope-paratope interactions of a monoclonal antibody targeting CEACAM5-expressing tumors[J]. Nat Commun, 2024, 15(1):9377.

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